Le projet vise à lutter contre les infections nosocomiales, qui apparaissent au moins 48 h après une hospitalisation ou la pose d'un dispositif médical. Ces infections, causées par divers agents pathogènes, concernent 750 000 cas annuels en France, avec 9 000 décès, dont 4 000 imprévus (sources : Pasteur, INSERM). À l'échelle mondiale, elles provoquent 700 000 morts par an, dont 23 000 aux États-Unis. En l'absence de solutions efficaces, ce chiffre pourrait atteindre 10 millions de décès d'ici 2050. La résistance aux traitements actuels rend urgente la recherche d'alternatives, comme l'utilisation d'enzymes catalysant la production de composés halogénés ou pseudo-halogénés à fort potentiel antimicrobien.

Au CRPP, des recherches sur les hémoprotéines, notamment la myéloperoxydase, ont démontré leur efficacité antimicrobienne dans le cadre du projet ANR MicrobicidalEnzyme. Cependant, le Staphylococcus aureus, qualifié de « voleur de fer », pourrait inactiver ces enzymes en captant leur fer. Les haloperoxydases à vanadium représentent une alternative prometteuse. Ces enzymes, extraites de macroalgues rouges comme Asparagopsis taxiformis, catalysent l'halogénation de composés organiques via la production d'intermédiaires (HOCl, HOBr, HOI). Ces intermédiaires participent à la détoxication du peroxyde d'hydrogène et à la prévention des biofilms bactériens.

Des études montrent que la mutation de résidus clés, comme HIS496 ou ARG du site actif dans la bromoperoxydase de Curvularia inaequalis, permet de moduler leur spécificité ou affinité pour des ions halogénures. Notre projet étudiera des haloperoxydases à vanadium déjà identifiées au CRPP comme acceptant les ions chlorure et bromure. L'objectif sera de modifier le site actif pour faciliter le relargage des intermédiaires antimicrobiens. En s'appuyant sur une étude fondamentale de ces enzymes et des études de relations structure-fonction, nous déterminerons les propriétés cinétiques à l'état stationnaire et préstationnaire de ces objets et les caractériserons à basse, moyenne ou haute résolution par DLS, SAXS, AFM, Microscopie ou cristallographie. Nous analyserons les enzymes sous formes APO et HOLO, en présence de H2O2, HOCl et HOBr. Des mutations ciblées permettront de déstabiliser l'interaction enzyme-composé, maximisant la libération des composés antimicrobiens.

Les tests sur enzymes mutées et sauvages (en présence de KCl ou KBr) viseront à évaluer leur efficacité antimicrobienne. Pour accroître ce potentiel, des approches de génie génétique rapprocheront spatialement une enzyme productrice de H2O2, telle que la glucose oxydase. Les techniques de fusion ou utilisant le SpyTag/Spycatcher seront envisagées. De plus, des combinaisons de myéloperoxydase et d'enzymes à vanadium seront testées pour élargir leur spectre antimicrobien.

Les résultats incluront une caractérisation enzymatique, biochimique et physico-chimique fine, ainsi que des objets bifonctionnels optimisés pour les applications antimicrobiennes. Ce projet posera les bases d'une solution antimicrobienne à large spectre.
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The project aims to combat nosocomial infections, which occur at least 48 hours after hospitalization or the placement of a medical device. These infections, caused by various pathogens, affect 750,000 cases annually in France, with 9,000 deaths, including 4,000 unexpected fatalities (sources: Pasteur, INSERM). Globally, nosocomial infections cause 700,000 deaths annually, including 23,000 in the United States. Without effective solutions, this figure could reach 10 million deaths by 2050. Resistance to current treatments underscores the urgent need for alternatives, such as enzymes that catalyze the production of halogenated or pseudo-halogenated compounds with significant antimicrobial potential.

At CRPP, research on hemoproteins, particularly myeloperoxidase, has demonstrated their antimicrobial efficiency as part of the ANR MicrobicidalEnzyme project. However, Staphylococcus aureus, known as the “iron thief,” could inactivate these enzymes by sequestering their iron. Vanadium haloperoxidases present a promising alternative. These enzymes, derived from red macroalgae such as Asparagopsis taxiformis, catalyze halogenation reactions by producing intermediates like HOCl, HOBr, and HOI. These intermediates detoxify hydrogen peroxide and prevent bacterial biofilm formation.

Studies reveal that mutating key residues, such as HIS496 or ARG in the active site in the bromoperoxidase of Curvularia inaequalis, can modulate substrate specificity or affinity for halide ions. Our project will focus on vanadium haloperoxidases already identified at CRPP as capable of processing chloride and bromide ions. The goal will be to modify the active site to enhance the release of antimicrobial intermediates. Based on a fundamental study of these enzymes and structure-function relationships, we will determine the kinetic properties at steady-state and presteady-state of these objects and characterize them at low, medium or high resolution by DLS, SAXS, AFM, microscopy or crystallography. We will analyze the enzymes in both APO and HOLO forms, in the presence of H2O2, HOCl, and HOBr. Targeted mutations will destabilize the enzyme-intermediate interaction, maximizing the release of antimicrobial compounds.

Tests on wild-type and mutated enzymes (in the presence of KCl or KBr) will assess their antimicrobial efficiency. To further enhance this potential, genetic engineering strategies will spatially pair the haloperoxidase with an H2O2-producing enzyme, such as glucose oxidase. Fusion or SpyTag/Spycatcher techniques will be considered. Additionally, combinations of myeloperoxidase and vanadium enzymes will be tested to broaden their antimicrobial spectrum.

The results will include detailed enzymatic, biochemical, and physicochemical characterizations, along with optimized bifunctional objects for antimicrobial applications. This project will lay the foundation for a broad-spectrum antimicrobial solution.
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Début de la thèse : 01/09/2025

Funding category:

Contrat doctoral libre