Les récepteurs ionotropiques AMPA (AMPAR) sont les principaux médiateurs de la neurotransmission excitatrice rapide dans le système nerveux central. Ils sont stabilisés au niveau des synapses par des interactions avec des partenaires protéiques intracellulaires, transmembranaires et extracellulaires en réponse à l'activité synaptique.



L'absence d'informations structurelles sur la manière dont les protéines de la fente synaptique contrôlent l'abondance des AMPAR limite actuellement la compréhension mécaniste de la signalisation physiologique des AMPAR.



L'objectif de ce projet est de développer des variantes de la pentraxine neuronale (NP) modifiées par affinité et d'utiliser ces molécules pour isoler des complexes avec des récepteurs AMPA natifs (nAMPARs) à partir de tissus cérébraux. Cela permettra de déterminer leur structure par cryo-microscopie électronique. Ce travail révélera la base moléculaire et structurelle de l'interaction entre les NP et les protéines AMPAR.



En utilisant des techniques avancées de biologie structurale et de biophysique, le projet vise à comprendre comment les AMPAR sont recrutés et regroupés par les NP.



À ce jour, il n'existe aucune structure de récepteurs AMPA en complexe avec une protéine d'interaction endogène putative à l'intérieur de la fente synaptique. Une multitude de structures AMPAR de pleine longueur ont été rapportées dans divers états (activé, inactivé, désensibilisé) et en complexe avec une variété de sous-unités auxiliaires associées à la membrane qui influencent la conductance du canal, les propriétés de gating et le ciblage synaptique. Ces structures ont permis de découvrir une mine d'informations pharmacologiques. Cependant, la base structurelle de la façon dont les protéines de l'« interactome extracellulaire » des AMPARs dans la fente synaptique s'engagent avec les propriétés du récepteur et les modulent est totalement absente. La base structurelle de la façon dont la NP accumule les AMPARs à la synapse constituerait donc une avancée majeure dans la compréhension de la biologie des AMPARs et permettrait leur interrogation fonctionnelle complète.



En relation avec ce qui précède, un facteur clé qui a eu un impact sur les études structurales des complexes AMPAR avec les protéines synaptiques est leur nature transitoire et leur faible affinité d'interaction, ce qui est probablement crucial pour permettre la dynamique de signalisation nécessaire sur de courtes échelles de temps. En effet, nous avons constaté que l'affinité d'interaction entre les NP produites de manière recombinante et l'AMPAR est de l'ordre du micromolaire élevé (μM). Nous développerons une stratégie générale pour surmonter ce problème général en introduisant des méthodes d'ingénierie des protéines pour stabiliser ces interactions protéine-protéine transitoires. Concrètement, nous développerons un flux de travail qui utilise des méthodes combinatoires pour construire des bibliothèques de séquences de molécules synaptiques, couplées à une procédure de sélection basée sur l'affichage de surface de levure (YSD) pour isoler des variants de séquences avec une affinité améliorée. Cela permettra de générer des complexes stabilisés qui se prêtent à des études structurales par cristallographie aux rayons X et cryo-EM. Une telle approche est sans précédent dans la biologie structurale des protéines neuronales et permettra d'effectuer des études structurales de ces interactions jusqu'ici difficiles à résoudre.
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AMPA ionotropic glutamate receptors (AMPARs) are the major mediators of fast excitatory neurotransmission in the central nervous system. They are stabilized at synapses through interactions with intracellular, transmembrane and extracellular protein partners in response to synaptic activity.



The absence of structural information for how synaptic cleft proteins control AMPAR abundance currently limits the mechanistic understanding of physiological AMPAR signaling.



The goal of this project is to develop affinity-engineered variants of Neuronal Pentraxin (NP) proteins, and to use these molecules for isolating complexes with native AMPA receptors (nAMPARs) from brain tissue. This will in enable their structure determination by cryo-electron microscopy. This work will reveal the molecular and structural basis of the interaction between NP and AMPAR proteins.



By employing advanced techniques of structural biology and biophysics, the project to understand how AMPARs are recruited and clustered by NPs.



To date, there are no structures of AMPA receptors in complex with any putative endogenous interacting protein partner from within the synaptic cleft. A host of full-length (FL) AMPAR structures have been reported in a variety of states (activated, inactivated, desensitized) and in complex with a variety of membrane-associated auxiliary subunits that influence channel conductance, gating properties, and synaptic targeting. These structures have uncovered a wealth of pharmacological information. However, the structural basis for how proteins of the “extracellular interactome” of AMPARs within the synaptic cleft engage with and modulate receptor properties is completely lacking. The structural basis for how NP accumulates AMPARs at the synapse would thus be a major advance in the understanding of AMPAR biology and enable their full functional interrogation.



Related to the above, a key factor that has impacted structural studies of AMPAR complexes with synaptic proteins is their transient nature and low interaction affinity, which is likely crucial for allowing the necessary signaling dynamics on short timescales. Indeed, we have found that the interaction affinity between recombinantly produced NP for the AMPAR is in the high micromolar (μM) range. We will develop a general strategy to overcome this general problem by introducing protein engineering methods to stabilize these transient protein-protein interactions. Concretely, we will develop a workflow that utilizes combinatorial methods to construct sequence libraries of synaptic molecules, coupled to a yeast surface display (YSD)-based selection procedure to isolate sequence variants with improved affinity. This will lead to the generation of stabilized complexes that are suitable for structural studies by X-ray crystallography and cryo-EM. Such an approach is unprecedented in structural biology of neuronal proteins and will unlock structural studies of these previously intractable interactions.
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Début de la thèse : 01/10/2025

Funding category: Autre financement public

Financement ANR