Clarification of cytotoxic and genotoxic effects of persistent organic and inorganic pollutants on fish cells and tissues in vitro

Aquatic environments are increasingly threatened by a complex mixture of pollutants, including persistent organic pollutants (POPs) and inorganic contaminants like heavy metals. Fish, being key components of aquatic ecosystems, are particularly vulnerable to these pollutants. Erythrocytes, the oxygen-carrying cells in fish blood, are directly exposed to waterborne contaminants and can serve as sensitive indicators of toxicity. Understanding the mechanisms by which these pollutants affect fish erythrocytes is crucial for assessing the overall health of aquatic ecosystems and the potential risks to human consumers of fish. Fish explant tissue culture is a valuable tool in toxicology research, offering several advantages over traditional in vivo studies and cell line-based approaches. This technique involves maintaining three-dimensional tissue fragments outside the organism, allowing researchers to study the effects of toxicants on specific organs or tissues in a controlled environment. 

While the toxic effects of individual pollutants on fish have been studied, the combined impact of POPs and inorganic pollutants on fish erythrocytes and tissues remains poorly understood. Furthermore, the specific cellular and molecular mechanisms underlying the toxicity of these pollutants on fish erythrocytes, including oxidative stress, genotoxicity, and disruption of cellular function, require further investigation.

Research questions:

1. What are the cytotoxic effects of selected POPs and inorganic pollutants on fish erythrocytes and explant tissues in vitro?

2. Do POPs and inorganic pollutants induce oxidative stress in fish erythrocytes and tissues, and what are the underlying mechanisms?

3. Can we identify specific biomarkers of exposure to these pollutants, based on altered gene expression or cellular function in fish erythrocytes?

4. What are the effects of POPs and anorganic pollutants on fish explant tissues, and is it possible to use them as a model in ecotoxicology?

Methodology

Selection of relevant fish species; Collection of blood samples from healthy fish; - Preparation of fish explant tissues.

In Vitro Exposure Experiments: Selection of representative POPs and inorganic pollutants; Preparation of pollutant stock solutions and exposure concentrations; Incubation of fish erythrocytes with pollutants for different time periods; - Incubation of fish explant tissues with pollutants for different time periods.

Cytotoxicity Assays: Cell viability assays, LDH release; Hemolysis assay; Measurement of oxyhemoglobin release; Morphological analysis - Microscopic examination of erythrocyte morphology.

Oxidative Stress Markers: Measurement of ROS generation; measurments of TAS, Quantification of lipid peroxidation: TBARS assay; Measurement of antioxidant enzyme activity: SOD, GPx, catalase, glutathione reductase; 

Genotoxicity Assays: Comet assay - Assessment of DNA damage in cells.

The work will use the equipment of the Laboratory of Clinical Biochemistry and Hematology, the Laboratory of Cellular and Subcellular Structures (ÚAB), the Laboratory of Experimental Biology and integral laboratories of the AgroBioTech Research Center, the Center of Excellence for White-Green Biotechnology, as well as partner institutions in Slovakia and abroad.

Expected benefits

These in vitro techniques provide valuable insights into the cytotoxic, genotoxic, and oxidative stress effects of pollutants on fish cells and tissuess. They allow for the assessment of various cellular and molecular changes, making them useful tools for ecotoxicological studies and biomonitoring of aquatic environments.

Objasnenie cytotoxických a genotoxických účinkov perzistentných organických a anorganických polutantov na bunky a tkanivá rýb in vitro

Vodné prostredie je čoraz viac ohrozované komplexnou zmesou znečisťujúcich látok vrátane perzistentných organických polutantov (POP) a anorganických znečisťujúcich látok. Ryby, ktoré sú kľúčovými zložkami vodných ekosystémov, sú obzvlášť citlivé na tieto znečisťujúce látky. Erytrocyty, bunky prenášajúce kyslík v rybej krvi, sú priamo vystavené kontaminantom vo vode a môžu slúžiť ako citlivé indikátory toxicity. Pochopenie mechanizmov, ktorými tieto znečisťujúce látky ovplyvňujú rybie erytrocyty, je kľúčové pre posúdenie celkového zdravia vodných ekosystémov a potenciálnych rizík pre konzumentov rýb. Explantátové tkanivové kultúry sú cenným nástrojom v toxikologickom výskume, ktorý ponúka niekoľko výhod oproti tradičným in vivo štúdiám alebo prístupom založeným na bunkových líniách. Táto technika zahŕňa udržiavanie trojrozmerných fragmentov tkaniva mimo organizmu, čo umožňuje výskumníkom študovať účinky toxických látok na konkrétne orgány alebo tkanivá v kontrolovanom prostredí.

Zatiaľ čo toxické účinky jednotlivých znečisťujúcich látok na ryby boli študované, kombinovaný vplyv POPs a anorganických polutantov na rybie erytrocyty a tkanivá zostáva nedostatočne pochopený. Okrem toho špecifické bunkové a molekulárne mechanizmy, ktoré sú základom toxicity týchto znečisťujúcich látok na rybích erytrocytoch, vrátane oxidačného stresu, genotoxicity a narušenia bunkovej funkcie, si vyžadujú ďalšie skúmanie.

Výskumné otázky:

1. Aké sú cytotoxické účinky vybraných POPs a anorganických polutantov na rybie erytrocyty a explantátové tkanivá in vitro?

2. Vyvolávajú POPs a anorganické znečisťujúce látky oxidačný stres v erytrocytoch a tkanivách rýb a aké sú základné mechanizmy?

3. Dokážeme identifikovať špecifické biomarkery expozície týmto znečisťujúcim látkam na základe zmenenej génovej expresie alebo bunkovej funkcie v rybích erytrocytoch?

4. Aké sú účinky POPs a anorganických polutantov na tkanivá explantátov rýb a je možné ich použiť ako model v ekotoxikológii?

Metodológia

Výber príslušných druhov rýb; Odber vzoriek krvi zo zdravých rýb; Príprava explantátových tkanív rýb.

Experimenty s expozíciou in vitro: Výber reprezentatívnych POPs a anorganických znečisťujúcich látok; Príprava zásobných roztokov znečisťujúcich látok a expozičných koncentrácií; Inkubácia erytrocytov rýb so znečisťujúcimi látkami počas rôznych časových období;  Inkubácia explantátových tkanív rýb so znečisťujúcimi látkami počas rôznych časových období.

Testy cytotoxicity: Testy životaschopnosti buniek, uvoľňovanie LDH; Test hemolýzy; Meranie uvoľňovania oxyhemoglobínu; Morfologická analýza - Mikroskopické vyšetrenie morfológie erytrocytov.

Markery oxidačného stresu: Meranie tvorby ROS; merania TAS, kvantifikácia peroxidácie lipidov: test TBARS; Meranie aktivity antioxidačných enzýmov: SOD, GPx, kataláza, glutatiónreduktáza;

Testy genotoxicity: Kométový test - Hodnotenie poškodenia DNA v bunkách.

Pri práci sa bude využívať prístrojové vybavenie Laboratória klinickej biochémie a hematológie, Laboratória bunkových a subcelulárnych štruktúr (ÚAB), Laboratória experimentálnej biológie a integrálnych laboratórií Výskumného centra AgroBioTech, Centra excelentnosti pre bielo-zelenú biotechnológiu, ako aj partnerských inštitúcií na Slovensku a v zahraničí.

Očakávané prínosy

Tieto in vitro techniky poskytujú cenné poznatky o cytotoxických, genotoxických a oxidačných stresových účinkoch znečisťujúcich látok na rybie bunky a tkanivá. Umožňujú hodnotenie rôznych bunkových a molekulárnych zmien, čo z nich robí užitočné nástroje pre ekotoxikologické štúdie a biomonitoring vodného prostredia.

More information about PhD position

Additional research info: anton.kovacik@uniag.sk

https://fbp.uniag.sk/sk/molekularna-biologia-6625/

https://fbp.uniag.sk/sk/phd-stupen/

https://is.uniag.sk/prihlaska/